마비 후 걷기를 회복시키는 뉴런

Nature 611권, 540~547페이지(2022)이 기사 인용

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척수 손상은 뇌와 뇌간에서 요추 척수로 연결되는 경로를 방해하여 마비를 초래합니다. 여기서 우리는 신경 재활 동안 적용되는 요추 척수의 시공간 경막외 전기 자극(EES)1,2,3(EESREHAB)이 만성 척수 손상을 입은 9명의 환자의 보행을 회복했다는 것을 보여줍니다. 이러한 회복에는 걷는 동안 인간의 요추 척수의 신경 활동 감소가 포함됩니다. 우리는 이 예상치 못한 감소가 척수 손상 후 환자가 걷는 데 필수적인 특정 신경 하위 집단의 활동 의존적 선택을 반영한다는 가설을 세웠습니다. 이러한 추정 뉴런을 식별하기 위해 우리는 생쥐에서 EESREHAB의 기본 기술 및 치료 기능을 모델링했습니다. 우리는 마비로부터의 회복에 대한 공간적으로 해결된 분자 아틀라스를 도표화하기 위해 이들 쥐의 척수에 단일 핵 RNA 시퀀싱6,7,8,9 및 공간 전사체학10,11을 적용했습니다. 그런 다음 걷기 회복과 관련된 뉴런을 식별하기 위해 세포 유형과 공간 우선 순위를 사용했습니다. 중간판 내에 자리잡은 흥분성 개재뉴런의 단일 집단이 나타났다. 이러한 뉴런은 척수 손상 전 걷기에 필요하지 않지만 척수 손상 후 EES로 걷는 회복에 필수적임을 입증합니다. 이러한 뉴런의 활동을 증가시키면 EESREHAB에 의해 가능해진 보행 회복이 표현되는 반면, 이를 절제하면 중등도 척수 손상 후 자발적으로 발생하는 보행 회복이 방해됩니다. 따라서 우리는 마비 후 걷기를 회복하는 데 필요하고 충분한 회복 조직 신경 하위 집단을 확인했습니다. 또한, 우리의 방법론은 분자 지도 제작을 사용하여 복잡한 행동을 생성하는 뉴런을 식별하기 위한 프레임워크를 구축합니다.

걷기를 조율하는 뉴런은 요추 척수에 있습니다14. 걷기 위해 뇌는 뇌간에서 계단식으로 이어지는 하강 경로를 통해 명령을 방송하여 이러한 뉴런을 활성화합니다15,16. 심각한 척수 손상(SCI)은 이 정교하게 조직된 의사소통 시스템을 분산시킵니다15. 요추 척수에 위치한 뉴런은 부상으로 인해 직접적으로 손상되지 않지만 필수 척수상 명령의 고갈로 인해 해당 뉴런이 기능하지 않게 됩니다4. 그 결과는 영구적인 마비입니다.

고립된 사례 연구에서는 EES가 요추 척수의 비기능 뉴런을 즉시 재활성화하여 마비 환자가 걸을 수 있게 한다고 보고했습니다1,18,19,20. 신경 재활(EESREHAB) 중 EES를 적용하면 자극이 꺼진 경우에도 걷기 회복이 더욱 향상되었습니다1,21.

EESREHAB이 요추 척수를 연결하고 리모델링하여 보행을 회복시키는 생물학적 원리는 아직 알려지지 않았습니다. 여기에서 우리는 EESREHAB이 마비 후 걷기에 필요한 척수의 필수 아직 확인되지 않은 뉴런을 연결하고 개조해야 한다는 가설을 세웠습니다.

우리는 먼저 EESREHAB이 SCI를 앓고 있는 대규모 인구 집단의 보행을 복원할 수 있는지, 그리고 이러한 회복에 요추 척수의 리모델링이 포함되는지 여부를 테스트했습니다.

인간의 보행 회복을 개선하기 위해 EESREHAB의 안전성과 타당성을 확립하는 것을 목표로 하는 최초의 인간 임상 시험 'Stimulation Movement Overground'(STIMO)(clinicaltrials.gov: NCT02936453; 보충 정보)에 9명의 개인이 등록되었습니다. 만성 SCI로. EESREHAB은 생체 모방 EES 프로토콜1,2,18의 폐쇄 루프 제어를 가능하게 하는 다중 전극 패들 리드에 인터페이스된 외과적으로 이식된 신경 자극기와 다방향 로봇 지원 시스템1,22에서 지원되는 지상 신경 재활을 결합합니다(그림 1a 및 보충 표 1). . 처음 6명의 참가자는 심각하거나 완전한 운동 마비를 나타냈지만 모두 다리에 어느 정도 감각이 남아 있었습니다. 나머지 3명의 참가자는 완전한 감각운동 마비를 겪었습니다. 처음 6명의 참가자에게는 원래 신경병증성 통증을 치료하기 위해 개발된 용도가 변경된 패들 리드가 이식되었고1 마지막 3명의 참가자에게는 흉추, 요추 및 천골 등뿌리의 앙상블을 목표로 하는 새로 설계된 특수 목적의 패들 리드가 이식되었습니다. 걷기의 생산18.

5/session; mixed-effects model, t = –6.40, P = 2.9 × 10–8). e, f, The role of SCVsx2::Hoxa10 neurons in the reorganization of muscle responses to EES was evaluated using Cre-dependent expression of Gi, e, or Gq DREADDs in SCVsx2::Hoxa10 neurons, f. The timelines summarize the timing of the various experimental procedures. The photographs illustrate the expression of DREADD receptors in SCVsx2::Hoxa10 neurons. Long-latency muscle responses to single-pulse of EES were quantified before and 30 min after CNO injections that either silenced (Gi) or activated (Gq) SCVsx2::Hoxa10 neurons. Bar plots report the integral of the RMS of long-latency muscle responses for each each experimental condition (n = 5 mice per group (Gi); paired samples two-tailed t-test, t = 2.4, P = 0.046; n = 5 mice per group (Gq); paired samples two-tailed t-test, t = 2.8, P = 0.047). g, Three complementary strategies were used to evaluate the role of SCVsx2::Hoxa10 neurons during basic unskilled walking in uninjured mice: targeted injections of AAV5-flex-hm4di (Gi) or AAV5-flex-Jaws in the lumbar spinal cord of Vsx2Cre mice to evaluate the short-term or immediate impact of silencing SCVsx2::Hoxa10 neurons, and targeted injection of AAV-flex-DTR to evaluate the long-term impact of the complete ablation of SCVsx2::Hoxa10 neurons. Locomotor performance was evaluated during overground walking using the procedures detailed in Extended Data Fig. 2e (n > 20 gait cycles per mouse, n = 5 mice per group). The bar plot reports locomotor performance, quantified as average scores on PC1 (n = 5 mice per group except for DTR with n = 8 mice per group; paired samples two-tailed t-test, Gi: t = 1.4; P = 0.23; LED: t = 1.5, P = 0.21; DTR: t = 1.1, P = 0.33), and the number of SCVsx2::Hoxa10 neurons per tissue section (SCVsx2::Hoxa10 ablation, n = 7 mice; no ablation, n = 4 mice; independent samples two-tailed t-test, t = 12.3, P = 6.2 × 10–7). Bar plots show the mean with individual data points overlaid. Error bars show the standard error of the mean. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001./p>

20 per mouse, n = 4 mice per group). Bars report n = 4 mice per group; statistics indicate Tukey HSD tests following repeated measures ANOVA, P < 10–15, P = 0.003 and P = 0.002, respectively. c, As in b, but during acute silencing of SCVsx2::Hoxa10 neurons with Gi in mice that underwent four weeks of EESREHAB (n = 4 mice per group; statistics indicate Tukey HSD tests following one-way ANOVA, P = 7.2 × 10–10, P = 2.1 × 10–5, P = 0.0006 respectively). d, As in c, but during acute activation of SCVsx2::Hoxa10 neurons with Gq in mice tested at four weeks post-SCI (no EESREHAB) with EESOFF and EESON (n = 4 mice per group; statistics indicate Tukey HSD tests following one-way ANOVA, P = 3.1 × 10–5, P = 4.4 × 10–7, P = 3.1 × 10–5, P = 0.0069 respectively). e, As in d, but following the chronic silencing of SCVsx2::Hoxa10 neurons (Gi, CNO in drinking water) in mice that underwent four weeks of EESREHAB, chronic activation of SCVsx2::Hoxa10 neurons (Gq, CNO in drinking water) in mice after SCI, and chronic activation of SCVsx2::Hoxa10 neurons (Gq, CNO in drinking water) in mice that underwent four weeks of rehabilitation without EES (n = 5 mice per group; statistics indicate Tukey HSD tests following one-way ANOVA, P = 0.0007, P = 1.6 × 10–5, P = 0.004, P = 0.011, respectively). f, Chronic silencing of SCVsx2::Hoxa10 neurons during EESREHAB altered the connectome and projectome of SCVsx2::Hoxa10 neurons compared to mice that underwent EESREHAB. 3D reconstructions show the labeled neurons in the reticular formation 3 days following the infusion of Cre-dependent PRV Ba2017 in the lumbar spinal cord of Vsx2Cre mice. The density of vGluT1 synapses apposing SCVsx2::Hoxa10 neurons was quantified to evaluate the synaptic projection from large-diameter afferent fibers onto SCVsx2::Hoxa10 neurons. The projectome of SCVsx2::Hoxa10 neurons was vizualized using infusions of AAV-flex-tdTomato in the lumbar spinal cord. The bar plots show the average number of vGluT1 synapses apposing SCVsx2::Hoxa10 neurons (n = 6 mice per group; independent samples two-tailed t-test, t = –3.1, P = 0.018), the number of neurons in the reticular formation (n = 4 and 3 mice per group, respectively; independent samples two-tailed t-test, t = –4.3, P = 0.0076), and the density of projections from SCVsx2::Hoxa10 neurons in the ventral horn (n = 4 mice per group; independent samples two-tailed t-test, t = –9.2, P = 0.0003). g, The impact of the chronic ablation of SCVsx2::Hoxa10 neurons on the natural recovery of mice with thoracic lateral hemisection SCI was evaluated as in Extended Data Fig. 13g, and summarized in the timeline of experiments. Photographs show coronal sections of the hemisected spinal cord at the lesion epicenter, while CLARITY-optimized light sheet microscopy illustrates the interruption of the reticulospinal tract on the hemisected side. Locomotor performances were evaluated as detailed in the other panels. Bar plots, n = 5 mice per group; independent samples two-tailed t-test, t = 6.6, P = 0.0002; t = –3.4, P = 0.09; t = –1.9, P = 0.093, respectively). h, Photographs show coronal sections of the spinal cord with Vsx2 RNAScope, confirming the reduction in the number of SCVsx2::Hoxa10 neurons in the lumbar spinal cord of Vsx2Cre mice after diphtheria toxin injections. Bar plots report the mean number of Vsx2 labeled neurons per section in the spinal grey matter (SCI n = 3, SCI with SCVsx2::Hoxa10 ablation n = 4 mice; independent samples two-tailed t-test, t = 9.5, P = 0.0001). Photographs below show examples of projections from reticulospinal neurons in the lumbar spinal cord in both groups of mice. The plot reports the mean density of reticulospinal projections across the dorsoventral extent of the spinal cord for mice with SCI (n = 3) and mice with SCI and ablation of SCVsx2::Hoxa10 neurons (n = 4). Ribbons show the standard deviation (two-tailed Wilcoxon rank-sum test, W = 2008248, P < 10–15). Bar plots show the mean with individual data points overlaid. Error bars show the standard error of the mean. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001./p>

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